RT-PCR是將RNA的反轉(zhuǎn)錄（Reverse Transcription，RT）和cDNA的聚合酶鏈式擴增（PCR）相結(jié)合的技術，近年來得到快速發(fā)展和廣泛應用。首先，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄酶的作用，以RNA為模板，合成互補的DNA鏈（cDNA），再以cDNA為模板，通過PCR擴增合成目的片段。RT-PCR技術靈敏而且用途廣泛。獲得的cDNA可用于基因的擴增、克隆，基因表達水平的檢測，細胞內(nèi)RNA病毒的含量等。
 
A．反轉(zhuǎn)錄酶（Reverse Transcriptase，RTase）
自然界中廣泛存在著一類以RNA為遺傳物質(zhì)的反轉(zhuǎn)錄病毒，其攜帶的反轉(zhuǎn)錄酶是一類以RNA為模板，合成cDNA的DNA聚合酶。目前在生命科研領域中應用較為廣泛的有鳥類成髓細胞性白血病病毒（Avian Myeloblastosis Virus，AMV）反轉(zhuǎn)錄酶（AMV RT）、莫洛尼鼠白血病病毒(Moloney Murine L：Leukemin Virus，M-MLV) 反轉(zhuǎn)錄酶（M-MLV RT）及其改造重組體M-MLV（RNase H－）。AMV RT具有反轉(zhuǎn)錄活性高、zui適反應溫度較高（41～50℃）的特點，可以較好地克服由于模板二級結(jié)構造成的逆轉(zhuǎn)錄困難問題，然而由于AMV RT的RNase H活性高，易降解cDNA-RNA復合物中的RNA鏈，導致合成的cDNA片段偏短，一般為1 kb左右。M-MLV RT的RNase H活性較低，合成的cDNA可達3~4 kb，比較適宜全長cDNA的合成。但M-MLV RT擴增效率較低，zui適反應溫度在37℃左右，故對于具有復雜二級結(jié)構的RNA模板逆轉(zhuǎn)錄效果不佳。經(jīng)過定點突變的M-MLV RT（RNase H－），基本上消除了RNase H酶活性，并將酶的zui適反應溫度提高到42℃，大大提高了cDNA鏈的延伸性和產(chǎn)率，更適于完整基因的獲得。我公司提供的StarScript Reverse Transcriptase（Cat. No. A211）即為經(jīng)過多重定點突變、具有高擴增能力的RNase H酶活性缺失型M-MLV RT，非常適合用于較長的cDNA合成以及高比例的全長cDNA文庫的構建等。
 
B．模板RNA
反轉(zhuǎn)錄反應中作為模板的RNA樣品可以是提取的總RNA、mRNA或體外轉(zhuǎn)錄的RNA產(chǎn)物。提取RNA的方法多種多樣，如單相試劑法（TRIGene，Cat. No. P118；TRIGene LS，Cat. No. P119）、過柱純化法、磁珠法等。無論使用哪種方法，zui關鍵因素是抑制RNA酶活性并zui大限度地去除基因組DNA污染。
 
C．引物
用于反轉(zhuǎn)錄的引物應視實驗的具體情況選擇。常用的引物有Oligo(dT)12-18、隨機引物(Random Hexamer)和基因特異性引物(Gene-specific primer，GSP)。對于短的不具有發(fā)卡結(jié)構的真核細胞mRNA，三種引物都可采用。Oligo (dT)12-18只適用于具有PolyA尾巴的RNA，對無PolyA尾巴的原核生物的RNA、真核生物的rRNA、tRNA以及某些種類的真核生物的mRNA不適用。因Oligo (dT)12-18引物需與mRNA的PolyA尾結(jié)合，所以對RNA模板的質(zhì)量要求很高，即使模板有少量降解也會影響全長cDNA的合成量。隨機引物適用于任何類型的RNA模板，但由于特異性低，主要用于單一模板的RT-PCR反應。基因特異性引物是根據(jù)模板序列設計的互補引物，特異性好，但僅適用于目的序列已知的情況。
 
D．其它影響因素
反轉(zhuǎn)錄反應受多個因素的影響，如Mg2+濃度、引物退火溫度、擴增的循環(huán)數(shù)等。對于具有較高Tm值的引物，增加退火和延伸時的溫度對反應有利。較高的溫度有利于減少非特異的引物結(jié)合，因而提高特異產(chǎn)物的得率。反轉(zhuǎn)錄反應的優(yōu)化參見“1.7 RT-PCR常見問題及解決方案“部分。
 
E．一步法和兩步法RT-PCR
RT-PCR可以通過一步法或兩步法的形式來實現(xiàn)。一步法即將反轉(zhuǎn)錄和PCR擴增在同一管內(nèi)完成，減少加樣步驟，有助于減少污染。由于所有的cDNA產(chǎn)物都用于PCR擴增，其靈敏度非常高，尤其適用于檢測大量樣品和實時定量PCR。兩步法將反轉(zhuǎn)錄和PCR擴增分開進行，在選擇DNA聚合酶（如高保真度、高特異性、長片段等）和引物時具有更大的靈活性。